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納米金
氯金酸通過還原法制備出的顆粒
納米金即指金的微小顆粒，其直徑在1～100nm，具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子結合，且不影響其生物活性。由氯金酸通過還原法可以方便地制備各種不同粒徑的納米金，其顏色依直徑大小而呈紅色至紫色。
基本信息
| 中文名 | |
| 外文名 | AuNPs |
| 類別 | 金的微小顆粒 |
| 功效 | 高電子密度、介電特性和催化 |
| 直徑 | 1～100nm， |
發(fā)展歷史
自從16世紀歐洲現(xiàn)代化學的奠基人、杰出的醫(yī)師、化學家Paracelsus制備出“飲用金”用來治療精神類疾病以來，納米金就開始登上了科學的舞臺。1857年英國科學家法拉第在研究道爾頓的理論時，利用氯化金還原出含納米金的溶液，發(fā)現(xiàn)在其中加入少量電解質后，可使溶液由紅寶石色變?yōu)樗{色，并最終凝集為無色，而加入明膠等大分子物質便可阻止這種變化。盡管當時并不知道原因，但他的發(fā)現(xiàn)為納米金的應用奠定了科學基礎。1885年納米金溶液在美國常作為治療酗酒的主要成分；1890年Koch醫(yī)生發(fā)現(xiàn)結核桿菌不能夠在金的表面存活；1890年納米金被用來治療關節(jié)炎；1935年芝加哥外科專家Edward等人發(fā)現(xiàn)納米金溶液能有效的減輕患者病痛，強健體質。1939年Kausche和Ruska用電子顯微鏡觀察金顆粒標記的煙草花葉病毒，呈高電子密度細顆粒狀。1971年Faulk和Taylor首次采用免疫金染色(immunogold staining，IGS)將兔抗沙門氏菌抗血清與納米金顆粒結合，用直接免疫細胞化學技術檢測沙門氏菌的表面抗原，開創(chuàng)了納米金免疫標記技術。
檢測技術發(fā)展
納米金溶液
作為顯微鏡示蹤物
納米金
應用于相溶膠顆粒
均相溶膠顆粒免疫測定法(sol particle immunoassay， SPIA)是利用免疫學反應時
應用于流式細胞儀
應用于斑點免疫
斑點免疫金銀染色法(Dot-IGS，IGSS)是將斑點ELISA與免疫納米金結合起來的一種方法。將蛋白質抗原直接點樣在硝酸纖維膜上，與特異性抗體反應后，再滴加納米金標記的第二抗體，結果在抗原抗體反應處發(fā)生金顆粒聚集，形成肉眼可見的紅色斑點，此稱為斑點免疫金染色法(Dot-IGS)。此反應可通過銀顯影液增強，即斑點金銀染色法(Dot-IGS/IGSS)。
應用于斑點金
斑點金免疫滲濾測定法(dot immuno-gold filtration assay，DIGFA)是斑點免疫測定法(dot immunoboding assay，DIBA)中的一種，是1982年由Hawkes等人在免疫印跡技術基礎上改良發(fā)展起來的一項免疫學新技術。其原理完全同斑點免疫金染色法，只是在硝酸纖維膜下墊有吸水性強的墊料，即為滲濾裝置。在加抗原(抗體)后，迅速加抗體(抗原)，再加金標記第二抗體，由于有滲濾裝置，反應很快，在數(shù)分鐘內即可顯出顏色反應。與斑點免疫滲濾測定法(d o t immunotietration assay，DIFA)相比，所不同的是免加底物液，直接由紅色膠體金探針顯色，結果鮮艷，背景更清楚，可以在室溫下保存。該方法已成功地應用于人的免疫缺陷病病毒(HI)的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測。目前使用的有HCG試劑盒，AFP試劑盒，消化道腫瘤篩檢試劑盒。
應用于免疫層析
免疫層析法(gold immunochromatography assay， GICA)是將各種反應試劑以條帶狀固定在同一試紙條上，待檢標本加在試紙條的一端，將一種試劑溶解后，通過毛細作用在層析條上滲濾、移行并與膜上另一種試劑接觸，樣品中的待測物同層析材料上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發(fā)生特異性免疫反應。層析過程中免疫復合物被截留、聚集在層析材料的一定區(qū)域(檢測帶)，通過可目測的納米金標記物得到直觀的顯色結果。而游離標記物則越過檢測帶，達到與結合標記物自動分離之目的。GICA特點是單一試劑，一步操作，全部試劑可在室溫長期保存。這種新的方法將納米金免疫檢測試驗推進到～個嶄新的階段。
檢測中的應用
目前食品檢測分析一般采用化學分析法(CA)、薄層層析法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)，但需要繁瑣、耗時的前處理，樣品損失也較大。相對于靈敏度較低的CA和TLC方法，GC、HPLC的靈敏度較高，但操作技術要求高、儀器昂貴，并不適合現(xiàn)場快速測定和普及，而以納米金為免疫標記物的檢測技術正彌補了這些技術的缺點，在現(xiàn)代食品分析檢測中的運用也越來越多。
獸藥殘留
所謂獸藥殘留是指動物產品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及，或其代謝物，以及與獸藥有關的雜質的殘留。獸藥殘留既包括原藥也包括藥物在動物體內的代謝產物。主要的殘留獸藥有抗生素類、磺胺藥類、呋喃藥類、抗球蟲藥、激素藥類和驅蟲藥類。獸藥通常是通過在預防和治療動物疾病用藥、在飼料添加劑中使用以及在食品保鮮中引入藥物而帶來對食品的污染。人長期攝入含獸藥的動物性食品后，不但會對人體產生毒性作用，出現(xiàn)過敏反應，而且動物體內的耐藥菌株可傳播給人體，當人體發(fā)生疾病時，就給臨床上感染性疾病的治療帶來一定的困難，延誤正常的治療。另外有些殘留物還具有致畸、致癌、致突變作用。
Verheijen利用膠體金標記純化的抗鏈霉素單克隆抗體，對鏈霉素的檢測限為160ng/ml，檢測方便快速，不需要其他試劑和儀器，時間僅需lOmintl41。而使用膠體金免疫層析試紙條，在檢測蝦肉等組織試樣中殘留氯霉素(chloramphenicol，CAP)殘留時，靈敏度可達到 lng/ml，只需5～10min，并且與類似物沒有交叉反應。Yong Jin等也使用金標法來檢測動物血漿和牛奶中的新霉素殘留，其檢測限為10ng/mltl6J。鹽酸克倫特羅即β2受體興奮劑，俗稱“瘦肉精”能增強脂解和減慢蛋白質分解代謝，若在畜牧生產中使用，可明顯提高飼料轉化率和瘦肉率；但使用劑量過大，則會對動物和人(間接)的肝臟、腎臟等器官產生嚴重的毒副作用。盡管歐盟于1996年禁止在畜牧生產中使用該藥(EC Direc． tive 96/22/EC)，我國農業(yè)部也于1997年明令禁止，但國內“瘦肉精”中毒事件時有發(fā)生。劉見使用金標試紙法快速檢測檢測鹽酸克倫特羅，最小檢測量達到40ng/ml。現(xiàn)在商品化的試紙條產品現(xiàn)在也比較成熟，比利時UCB Bio-products公司開發(fā)的Tlhe Beta STAR檢測法就是將特定的β-內酰胺受體固定在試紙條上，用膠體金有色微粒作為標記物，5min內可以檢測到青霉素和頭孢霉素殘留。而國內的劉平在用生物電化學傳感器檢測牛奶中殘留的青霉素時，認為使用納米金將有助于提高傳感器的檢測限。
動物傳染病
動物傳染病不但會影響動物養(yǎng)殖經(jīng)濟，也對人類健康構成威脅，聯(lián)合國糧農組織和世界衛(wèi)生組織已把預防和控制嚴重的動物流行病作為其工作重點之一。蝦白斑病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是阻礙蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素，至今還沒有有效的藥物，所以及早檢測出病毒，顯得尤其重要。Wang Xiaojie等已成功研究了斑點免疫金滲濾法(DIGFA)t19~和金標試紙法來檢測蝦白斑病毒，其中金標試紙法的檢測限為1 μg/ml，而使用銀增強，可以達到0.01μg/ml。賴清金等使用金標試紙條來檢測豬瘟病毒，10～15min就能檢出結果，并可根據(jù)檢測結果合理指導豬瘟免疫和建立適宜的免疫程序。禽流感病毒(AIV)是引起禽類急性死亡的烈性、病毒性傳染病，而且能感染人，我國許多地區(qū)也先后報道有高致病性禽流感的發(fā)生，給養(yǎng)禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失，也嚴重威脅了人類的健康。劉永德等將兔抗禽流感H5、H9亞型病毒抗體純化后，分別與制備的膠體金研制成免疫金探針，用改良的滲濾法安全快速地檢測被檢材料中禽流感H5、H9亞型病毒，3min即可得到結果，檢測靈敏度分別為1.62ug/ml和1.25μg/ml。
農藥殘留
農藥殘留分析的困難包括：樣品基質背景復雜、前處理過程繁瑣，需要耗費較多的時間、被測成分濃度較低、分析儀器的定性能力受到限制、儀器檢測靈敏度不夠等一系列問題，但使用金標記的快速檢測可以很好的解決以上問題。國內的王朔分別使用納米金免疫層析和納米金滲濾法檢測西維因的殘留，整個檢測過程只需5min，檢測限也分別達到100ug/L和50μg/L。國內的生物技術公司也開發(fā)出了成熟的商品化產品，如克百威農殘速測試紙條等。
致病微生物檢測
目前基于金標記的快速檢測研究在致病微生物方面比較多，檢測的種類也比較多。最早Hasan以免疫磁性分離技術為基礎的免疫膠體金技術已成功應用于01群霍亂弧菌(Vibriocholerae)的檢測。國內洪幫興等人研究了以硝酸纖維膜為載體納米金顯色的寡核苷酸芯片技術，為在分子水平快速簡便的鑒別致病菌提供了可能，甚至可以檢出致病菌的耐藥性變異。該芯片技術對大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、變形桿菌、單核細胞增生李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、肉毒梭菌和空腸彎曲菌等10種(屬)具有高靈敏度和特異性，檢出水平可達10CFU/mlt251。殷涌光等在使用集成化手持式Spreeta TM SPR傳感器快速檢測大腸桿菌時，引入膠體金復合抗體作為二次抗體大幅度增加質量，進一步擴大了檢測信號，同時延長膠體金復合抗體與微生物的結合過程，使檢測信號進一步穩(wěn)定與放大，從而顯著提高了檢測精度，使該傳感器對大腸桿菌的檢測精度由10.6 CFU/ml提高到10.1CFU/ml。金免疫滲濾法重要的食源性致病菌之一大腸埃希氏菌0157：H7，目前的檢測通常先以山梨醇麥康凱瓊脂(sMAC)進行初篩，然后用生化和血清學試驗做鑒定，一般需要24～48h，而采用膠體金免疫滲濾法檢測卻非常的簡便，在很短時間即可得到結果。
在致病菌快速檢測中金標試紙條的研究越來越廣泛。謝昭聰?shù)葢媚z體金免疫層析法檢測水產品中霍亂弧菌的研究中，增菌液霍亂弧菌含量為1CFU/ml，通過增菌12h后，即可應用膠體金免疫層析法診斷試劑檢出，而一般水產品霍亂弧菌檢測所采用的傳統(tǒng)常規(guī)方法，檢測時限長，增菌培養(yǎng)需8～16h，分離培養(yǎng)需14～20h，初步報告需30h以上，實際操作中，需要3d以上才能出報告。腸桿菌科的大屬沙門氏菌可引起人的沙門氏菌性食物中毒，王中民等人采用免疫滲濾法可檢出85%的引起食物中毒的沙門氏菌，靈敏度為2.4×107CFU/ml，對最常見的鼠傷寒、豬霍亂和腸炎沙門氏菌，檢出率達100%，而采用膠體金免疫層析法的靈敏度為2.1×106CFU/mlt30j。被美國列為七種主要食源性致死病菌之一的李斯特菌，如果按照傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和鑒定技術需要l～2周時間，而采用免疫膠體金層析法只需10min就能得到檢測結果，靈敏度達到87.5%。
真菌毒素的檢測
真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌(Fungi)產生的具有毒性的二級代謝產物，廣泛存在食品和飼料中，人類若誤食受污染的食品，就會中毒或誘發(fā)一定疾病，甚至癌癥。檢測食品中的真菌毒素常用理化方法或生物學方法。但理化法需要較昂貴的儀器設備，操作復雜。而運用免疫技術檢測真菌毒素敏感性高，特異性強，非常適用于食物樣品的檢測。D．J．Chiao等使用金標免疫層析法在10min之內即可檢測50ng/ml的肉毒桿菌毒素B(BoNT/B)，如果使用銀增強則其檢測限可以達到50pg/ml，而且對A、E型肉毒桿菌毒素沒有交叉反應。貉曲霉毒素是曲霉屬和青霉屬產生的一類真菌毒素，其中毒性最大、與人類健康關系最密切、對農作物的污染最重、分布最廣的是赭曲霉素A(OTA)，賴衛(wèi)華等研制的赭曲霉毒素A快速檢測膠體金試紙條，檢測限達到了10ng/mlt331，遠遠低于目前我國對赭曲霉毒素的限量要求5μg/L。黃曲霉毒素B z的快速檢測國內也有很多研究，孫秀蘭研制的黃曲霉毒素B，金標免疫試紙條，其最低檢測限達到2．5ng/ml，而且能定性或半定量檢測食品中的黃曲霉毒素B，含量。
小 結
隨著科學技術的不斷發(fā)展，食品分析檢測技術也在不斷地更新、完善和迅速發(fā)展，尤其是快速檢測技術更能適應現(xiàn)代高效、快速的節(jié)奏和滿足社會的要求。儀器分析法可以保證數(shù)據(jù)的精確性和準確性，但其流程仍比較煩瑣。盡管以納米金為標記物的免疫分析法及其它速測技術的開發(fā)過程需投入較多資金和較長時間，但具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強、價廉、樣品所需量少等優(yōu)點，其靈敏度與常規(guī)的儀器分析一致，適合現(xiàn)場篩選，而且其中的金免疫層析技術正在向定量、半定量檢測和多元檢測的方向發(fā)展，更加體現(xiàn)出金標技術的優(yōu)勢。總之，快速檢測技術的快速、靈敏、簡便等優(yōu)點，使之在食品衛(wèi)生檢疫和環(huán)境檢測中有著廣泛的應用價值和發(fā)展前景。
制備方法
配制濃度為2.44×10-3 mol/L 的HAuCl4·4H2O溶液、濃度為3.43×10-2 mol/L 的Na3C6H5O7·2H2O 溶液、濃度為1.00×10-4 mol/L 的 PVP 溶液, 以及濃度為0.391 mol/L 的NaBH4 溶液備用。在燒杯中加入10 mL 氯金酸溶液, 10 mL 或不加保護劑溶液, 80 mL 三蒸水, 將燒杯置于數(shù)顯測速恒溫磁力攪拌器上, 邊加熱邊攪拌, 攪拌的轉速設置為600 r/min, 加熱至75℃, 恒溫2 min, 用移液管移取一定體積的還原劑(Na3C6H5O7 或NaBH4)溶液，迅速一次加入到上述混合液, 開始計時, 使液體顏色恒定并持續(xù)加熱一段時間共9 min, 停止加熱, 繼續(xù)攪拌5 min 后, 停止攪拌, 冷卻至室溫, 所得液體為納米金溶膠。
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